RFLP (Retiction Fragment Length Polymorphism)

(

Analisis Retiction Fragment Length Polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim retriksi terhadap DNA target

)
...

(

dari individu yang berbeda.

Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA. Analisis RFLP yang merupakan marker kodominan telah banyak digunakan untuk mencapai berbagai tujuan. Mengingat situs restriksi mempunyai sekuensi DNA tertentu, berarti variasi keberadaan situs restriksi mencerminkan adanya variasi sekuensi DNA. Dengan kata lain, RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi DNA. Variasi dideteksi dalam bentuk pemotongan rangkaian panjang polimorfik (ganda) yang mana waktu penilaian dari rangkaian variasi memungkinkan dari data fragmen itu sendiri, rangkaian variasi yang panjang dalam suatu bagian dapat dinilai dari subtitusi nukleotida.

Berbagai keunggulan penerapan marker RFLP antara lain :

1. Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis,

2. Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah

3. Memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter

4. Memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif

5. Menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik

6. Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas

7. Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies, populasi.

Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi :

1. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecah dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain.

Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi untuk mencegah DNA rusak. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk dibris sel, dilakukan dengan sentrifugasi

2. Pemotongan dengan enzim restriksi dan elektroforesis gel

DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi tertentu yang dipilh dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya di elektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai eteridium bromide, maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme. Dengan demikian perlu dilakukan hibridasi dan visualisasi dilakukan dengan Southern blotting.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.

3. Transfer DNA dengan Sothern blotting

4. Hibridisasi DNA

)